Sådan udføres en spektrofotometrisk analyse: 13 trin (med billeder)

Indhold

Trin
Fornødenheder

Spektrofotometri er en eksperimentel teknik, der bruges til at måle koncentrationen af opløste stoffer i en specifik opløsning ved at beregne mængden af lys absorberet af disse opløste stoffer. Denne teknik er kraftfuld, fordi visse forbindelser vil absorbere forskellige bølgelængder af lys med forskellige intensiteter. Ved at analysere lyset, der passerer gennem opløsningen, kan du identificere visse opløste stoffer i opløsning, og hvor koncentrerede disse stoffer er. Et spektrofotometer er den enhed, der bruges til at analysere opløsninger i et laboratoriemiljø.

Trin

Del 1 af 3: Forberedelse af prøverne

1. Tænd for spektrofotometeret. De fleste spektrofotometre skal varmes op, før de kan give en nøjagtig aflæsning. Tænd for enheden, og lad den sidde i mindst 15 minutter, før du kører prøver.

Brug opvarmningstiden til at forberede dine prøver.

Billede med titlen Udfør spektrofotometrisk analyse Trin 2

2. Rengør kuvetterne eller reagensglassene. Hvis du laver et skolelaboratorium, bruger du muligvis engangsreagensglas, der ikke skal renses. Hvis du bruger kuvetter eller genanvendelige reagensglas, skal du sørge for, at de er godt rengjorte inden brug. Skyl hver kuvette grundigt med deioniseret vand.

Vær forsigtig med kuvetter, da de kan være ret dyre, især hvis de er lavet af glas eller kvarts. Kvartskuvetter er designet til brug i UV-synlig spektrofotometri.

Når du håndterer kuvetten, må du ikke røre ved de sider, som lyset vil passere igennem (generelt de klare sider af røret). Hvis du ved et uheld rører ved disse sider, skal du tørre kuvetten af med en `kimwipe` (som er formuleret til at undgå at ridse glasset).

Billede med titlen Udfør spektrofotometrisk analyse Trin 3

3. Læg den passende mængde prøve i kuvetten. Nogle kuvetter har en maksimal volumen på 1 milliliter (mL), mens reagensglas kan have en maksimal volumen på 5 ml. Så længe laseren, der producerer lyset, passerer gennem væsken og ikke gennem en tom del af beholderen, vil du få en nøjagtig aflæsning.

Hvis du bruger en pipette til at indlæse dine prøver, skal du bruge en ny spids til hver prøve for at undgå krydskontaminering.

Billede med titlen Udfør spektrofotometrisk analyse Trin 4

4. Lav en kontrolopløsning. Kontrolopløsningen, eller `blind`, har kun det kemiske opløsningsmiddel, hvori opløsningen, der skal analyseres, er opløst. For eksempel, hvis du opløste salt i vand, ville din `blank` kun indeholde vand. Farver du vandet rødt, skal emnet også indeholde rødt vand. Blindprøven har samme volumen som opløsningen, der skal analyseres, og opbevares i samme type beholder.

Billede med titlen Udfør spektrofotometrisk analyse Trin 5

5. Tør ydersiden af kuvetten af. Før du placerer kuvetten i spektrofotometeret, skal du sikre dig, at den er så ren som muligt for at undgå interferens fra snavs eller støvpartikler. Brug en fnugfri klud til at fjerne vanddråber eller støv, der kan være på ydersiden af kuvetten.

Del 2 af 3: Kørsel af eksperimentet

Billede med titlen Udfør spektrofotometrisk analyse Trin 6

1. Vælg og indstil lysets bølgelængde til at analysere prøven med. Brug en enkelt bølgelængde af lys (monokromatisk farve) for at gøre testen mere effektiv. Lysets farve skal være en farve, der vides at blive absorberet af et af de kemikalier, der mistænkes for at være til stede i testopløsningen. Indstil den ønskede bølgelængde i henhold til specifikationerne for dit spektrofotometer.

I et klasseværelses laboratorium vil bølgelængden sandsynligvis blive givet.
Da prøven vil reflektere alt lys af samme farve, når den vises, vil den eksperimentelle bølgelængde altid være en anden farve end prøvens.
Objekter fremstår som bestemte farver, fordi de reflekterer lys af bestemte bølgelængder og absorberer alle andre farver. Græs er grønt, fordi klorofylet i græsset reflekterer grønt lys og absorberer alt andet.

Billede med titlen Udfør spektrofotometrisk analyse Trin 7

2. Kalibrer maskinen med `blank`. Læg emnet i kuvetteholderen og luk låget. På et analogt spektrofotometer vil der være en skærm med en nål, der bevæger sig baseret på intensiteten af lysdetektionen. Når emnet er i, bør du se nålen bevæge sig til højre. Bemærk denne værdi, hvis du får brug for den senere. Mens emnet stadig er i maskinen, skal du indstille nålen til nul med justeringsknappen.

Digitale spektrofotometre kan kalibreres på samme måde, de vil kun have en digital udlæsning. Indstil blanketten til nul med justeringsknapperne.

Når du fjerner emnet, er kalibreringen stadig korrekt. Ved måling af resten af prøverne trækkes blindprøvens absorbans automatisk fra.

Sørg for at bruge en enkelt blindprøve pr. session, så hver prøve er kalibreret til den samme blindprøve. For eksempel, hvis du tømmer spektrofotometeret, derefter kun analyserer nogle få prøver og tømmer spektrofotometret igen, ville de resterende prøver være unøjagtige. Så skal du i gang igen.

Billede med titlen Udfør spektrofotometrisk analyse Trin 8

3. Fjern emnet og test kalibreringen. Når emnet er fjernet, skal nålen forblive på 0 (nul), eller den digitale udlæsning skal forblive på nul. Placer emnet tilbage i enheden og kontroller, at nålen eller aflæsningen ikke ændres. Hvis maskinen er korrekt kalibreret med dit emne, bør alt forblive på nul.

Hvis nålen eller aflæsningen ikke er nul, gentages kalibreringstrinene med råemnet.

Hvis du fortsat har problemer, skal du få hjælp eller få enheden tjekket for problemer.

Billede med titlen Udfør spektrofotometrisk analyse Trin 9

4. Mål absorbansen af din eksperimentelle prøve. Fjern blindprøven og anbring den eksperimentelle prøve i enheden. Skub kuvetten ind i den passende rille, og sørg for, at den står oprejst. Vent ca. 10 sekunder, indtil nålen stopper, eller til de digitale tal holder op med at ændre sig. Bemærk værdierne for % transmission og/eller absorbans.

Absorbansen er også kendt som den optiske densitet (OD).

Jo mere lys der slippes igennem, jo mindre lys absorberer prøven. Generelt vil du skrive absorbansværdierne ned, som normalt vil blive angivet som decimaler. For eksempel: 0,43.

Hvis du får et unormalt resultat (som 0,900, mens resten er omkring 0,400), fortynd prøven og mål absorbansen igen.

Gentag målingen for hver enkelt prøve mindst tre gange og gennemsnit målingerne. Dette giver en mere præcis læsning.

Billede med titlen Udfør spektrofotometrisk analyse Trin 10

5. Gentag testen med på hinanden følgende bølgelængder af lys. Din prøve kan indeholde flere ukendte forbindelser, hvis absorbans varierer afhængigt af bølgelængden. For at udelukke usikkerhed, gentag målingerne med 25 nm intervaller over hele spektret. På denne måde kan du opdage andre kemikalier, som du har mistanke om er i det opløste stof.

Del 3 af 3: Analyse af absorbansdata

Billede med titlen Udfør spektrofotometrisk analyse Trin 11

1. Beregn prøvens transmission og absorbans. Transmission angiver, hvor meget af lyset, der passerede gennem prøven, nåede spektrofotometeret. Absorption er, hvor meget af lyset, der er blevet absorberet af et af kemikalierne i det opløste stof. Mange moderne spektrofotometre viser transmission og absorption, men når du har registreret intensiteten, kan du beregne disse værdier.

Transmittansen (T) findes ved at dividere intensiteten af lyset, der er passeret gennem prøveopløsningen, med mængden, der er passeret gennem blindprøven. Det er normalt udtrykt som en decimal eller som en procentdel. T = I/I₀ hvor I er intensiteten af prøven og I₀ blankets intensitet.
Absorbansen (A) udtrykkes som det negative af logaritmen (eksponenten) af transmissionsværdien (base-10): A = -log₁₀t. For en T-værdi på 0,1 er værdien af A 1 (0,1 er 10 til -1. potens), hvilket betyder, at 10 % af lyset transmitteres og 90 % absorberes. For en T-værdi på 0,01 er værdien af A 2 (0,01 er 10 til -2. potens), hvilket betyder, at 1 % af lyset transmitteres.

Billede med titlen Udfør spektrofotometrisk analyse Trin 12

2. Plot absorbansværdierne mod bølgelængderne på en graf. Absorbansværdien er plottet på den lodrette y-akse mod bølgelængden af lys, der bruges til en bestemt test plottet på den vandrette x-akse. Plotning af de maksimale absorbansværdier for hver bølgelængde af det testede lys giver prøvens absorbansspektrum og identificerer forbindelserne, der udgør testkemikaliet, og deres forhold.

Et absorptionsspektrum har normalt toppe ved bestemte bølgelængder, som giver dig mulighed for at identificere specifikke forbindelser.

Billede med titlen Udfør spektrofotometrisk analyse Trin 13

3. Sammenlign dit absorptionsspektrum plot med kendte plots af specifikke forbindelser. Forbindelser har et unikt absorptionsspektrum og vil altid producere en top ved samme bølgelængde, hver gang de måles. Ved at sammenligne dine plots af ukendte forbindelser med dem af kendte forbindelser, kan du identificere de opløsningsmidler, der udgør din opløsning.

Du kan også bruge denne metode til at identificere forurenende stoffer i din prøve. Hvis du forventer en klar top ved en bestemt bølgelængde, og du får to toppe ved forskellige bølgelængder, så ved du, at der er noget galt i din prøve.